Н. Э. Лычковская, В. В. Чопяк, З. Д. Воробец

Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого

Введение. Значительная распространенность воспалительных заболеваний суставов, тенденция к неуклонному нарастанию их тяжести, высокие показатели в результате этого временной потери трудоспособности и инвалидности, особенно лиц среднего трудоспособного возраста, определяют важное медико-социальное значение этих болезней. На современном этапе РА и АС рассматриваются как заболевание, в основе которых лежат иммунные нарушения. Известно, что лимфоциты крови являются ключевыми клетками иммунной системы, которые играют ведущую роль в обеспечении компенсаторно-приспособительных реакций организма.

Разнообразие висцеральных проявлений воспалительных заболеваний заболеваний свидетельствует об участии универсальных механизмов реализации системного патолоґичного процесса с участием полипотентных мессенджеров, которые обладают мультифункциональными эффектами. К таким универсальным мессенджерам принадлежат оксид азота (NO), ионы кальция Са²⁺ (Са²⁺), которые прямо или косвенно регулируют различные физиолого-биохимические процессы. Исследования последних десятилетий в области биохимии и физиологии свидетельствуют, что прецизионный контроль (NO) и (Са²⁺) обеспечивается функционирование ферментативных систем клетки. Среди последних ведущая роль в поддержании NO- и ионного гомеостаза клетки принадлежит NO-синтазе, аргиназе и АТФ-азам. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению энзиматического спектра лимфоцитов, исследования функциональной активности их аргиназо-NO-синтазного и АТФ-азных систем крайне ограничены, а патофизиологические и иммунные механизмы их дисфункции – невыясненными.

Цель. Выяснить патофизиологические механизмы возникновения ревматоидного артрита и анкилозирующего спондилита с участием аргиназо-NO-синтазного и АТФ-гидролазних систем лимфоцитов крови и клеточного звена иммунитета.

Материалы и методы. После получения письменного согласия на проведение комплексного обследования в соответствии с принципами Хельсинкской декларации прав человека, Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине и соответствующих законов Украины, а также комплексного клинико-лабораторного и инструментального обследования всех  органов и систем в соответствии с требованиями современной медицины в рандомизированный способ привлечено в исследование 86 больных (48 женщин (56,0%) и 38 мужчин (44,0%) в возрасте от 18 до 56 лет), находившихся на стационарном лечении в ревматологическом отделении КЗ ЛОР “Львовская областная клиническая больница” в 2012-2015 гг. с предыдущей стратификацией при наличии у 50 больных РА (39 женщин (78,0%) и 11 мужчин (22,0%) в возрасте от 18 до 56 лет, с результатах обследований «Ревматоидный артрит: полиартрит; сероположительный вариант, anti-CCP (+ ) хроническое течение, с поражением мелких суставов кистей, стоп, луче-запястных, коленных суставов. Rtg II стадии; ФНС II степени») и у 36 больных АС (9 женщин (25,0%), 27 мужчин (75 0%) с результатах обследований «Анкилозирующий спондилит: акт. II степени; центральная форма, хроническое течение, с поражением илеосакральных соединений, тазобедренных, плечевых суставов, шейного отдела позвонка; Rtg ІІ стадия; ФНС II степени»)

Моноядерные лимфоциты периферической крови человека выделяли из гепаринизированной свежополучаемой крови в ґрадиенте плотности фикол-триумбраста [11]. Жизнеспособность лимфоцитов, которая во всех опытах составляла не менее 95,0%, оценивали по окраске трипановым синим. Для пермеабилизации мембран лимфоцитов крови и раскрытия латентных ферментативных активностей к суспензии лимфоцитов добавляли 0,1-0,3% сапонина.

Количественное определение популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли методом непрямой иммунофлуоресцентной реакции с моноклональными антителами к дифференцирующим антигенам поверхности клетки. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов по поглощающей способности проводили на основе метода, основанного на эндоцитозе фагоцитами частиц латекса, виализирующего в цитоплазме клеток в виде круглых гранул синего цвета.

Активность NO-синтазы определяли по специфическому расщеплению NADPH(H+). Активность арґиназы лимфоцитов крови определяли по образованию мочевины. Са²⁺, Мg²⁺ – и Na⁺, K⁺-ATФазную активность лимфоцитов крови определяли спектрофотометрически, регистрируя процесс гидролиза АТФ накоплением Р_і. Содержание протеина в лимфоцитарной смеси определяли по модифицированному методу А. Лоури.

Результаты исследований. В результате проведенных исследований выявлены изменения активности аргиназо-NO-синтазной системы лимфоцитов крови, нарушение функциональной активности клеток фагоцитарной системы и изменение соотношений субпопуляций Т-лимфоцитов у пациентов с воспалительными заболеваниями суставов. Рост активности iNOS у этих пациентов сопровождается компенсаторным ингибированием активности эндотелиальной изоформы NOS. Значительная активация iNOS активности ведет к избыточному образованию NO в лимфоцитах крови. NO в высоких концентрациях инициирует процессы оксидативного и нитрозивного стресса, которые ведут к нарушению прооксидантно-антиоксидантного равновесия. В результате этого происходит активация апоптичних механизмов и инициация деструктивных процессов в клетках, ведет к нарастанию дисфункции. В то же время, подавление активности ATФазних систем свидетельствует о перегрузке цитозоля лимфоцитов ионами Na⁺ и Ca²⁺ и нарушения ионного гомеостаза, способствует возникновению клеточных нарушений.

Выводы. У больных ревматоидным артритом в результате уменьшенного количества Т-цитотоксических лимфоцитов достоверно увеличивается количество Т-хелперов, натуральных киллерных клеток, активированных и регуляторных Т-лимфоцитов, клеток с супрессивной активацией, что указывает на активацию клеточного звена аутоагресии с включением регуляторных механизмов, а у больных анкилозирующим спондилитом – активация натуральных киллерных клеток, активированных Т-лимфоцитов, лимфоцитов с супрессивной активацией и снижение числа регуляторных лимфоцитов, что указывает на усиление им иммунологического воспалительного процесса. Более выраженные изменения хелперно-цитотоксических (CD4⁺ и CD8⁺), активированных (CD3⁺/CDHLA-DR⁺), супресивных (CD4^–/CD25⁺) Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (CD19⁺), регуляторных клеток (CD4⁺/CD25⁺) верифицированы у больных ревматоидный артрит, по сравнению с больными анкилозирующим спондилитом, что свидетельствует о наличии более мощной иммунозависимой аутоагресии у больных ревматоидным артритом.

Нарушение клеточного звена иммунитета сопровождается угнетением активности эндотелиальной NO-синтазы лимфоцитов крови пациентов с ревматоидным артритом на 34,9±7,8% (р<0,05), у пациентов с анкилозирующим спондилитом – на 43,4±6,2% (р <0,001) по сравнению с практически здоровыми лицами с одновременной активацией ее индуцибельной изоформы.

Активность арґиназы лимфоцитов крови пациентов с ревматоидным артритом увеличивается на 178,3±22,3% (р<0,001), с анкилозирующим спондилитом – на 272,6±30,2% (р<0,001) по сравнению с практически здоровыми лицами.

Нарушение синтеза NO сопровождалось угнетением активности Ca²⁺,Mg²⁺ – АТФазы плазматической мембраны лимфоцитов крови пациентов с РА на 46,8±5,7% (р<0,001), у пациентов с АС – на 39,4±6,4% (р < 0,001), активности Ca²⁺,Mg²⁺ -АТФазы мембран ЭПР лимфоцитов крови пациентов с обеими патологиями на 35,6±4,8% (р<0,001) и 20,0±3,8% (р<0,001) соответственно; активности Na⁺,K⁺-АТФазы лимфоцитов крови пациентов с обеими патологиями на 42,8±7,2% (р<0,001) и 39,7±6,5% (р<0,001) соответственно по сравнению с практически здоровыми лицами.

Изменения активностей аргиназо-NO-синтазной и АТФазной систем лимфоцитов крови у пациентов с ревматоидным артритом более выражены, чем с анкилозирующим спондилитом, однако чувствительным параметром является активность iNOS, что свидетельствует об определяющей роли нарушений в этой регуляторной системе для формирования и нарастания воспалительного поражения суставов.